慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，可有效地感染分裂细胞和非分裂细胞，所以慢病毒载体能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，能够方便快捷地实现基因的长期、稳定表达。
在使用慢病毒的过程中，可能因病毒的浓度、细胞的状态、操作规范和时间把握等出现各种问题，今天小恒就来和大家聊一聊在使用慢病毒过程可能会遇到的问题，如何解决这些问题~
1、什么是MOI？如何通过MOI计算需要加入的病毒量？
MOI，感染复数，是指每个细胞感染的病毒数，通常需要MOI值越高的细胞越难被感染。一般我们把某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。
相关计算公式：每孔加病毒量（μL）=MOI*细胞数/病毒滴度（TU/mL）×1000
MOI=（病毒滴度x病毒体积）/细胞数目
2、如何确定向细胞中加入慢病毒的最佳时间？
慢病毒感染细胞后2~3天可观察慢病毒携带的基因荧光表达情况，在细胞汇合度30~50%且细胞状态良好时加入慢病毒，确保在感染后2天时细胞增长达到70%左右的汇合度。
3、用于慢病毒感染的细胞接种量是多少？
根据细胞增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。
针对大部分细胞系：传代周期在2~3天，感染时细胞铺板的密度保持在30~50%左右
针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到70~80%左右
针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种。
4、慢病毒感染细胞后什么时间基因表达到达峰值？
慢病毒感染后大部分细胞会在3天左右GFP或目的基因表达达到峰值，但是对于生长缓慢的细胞，达到峰值的时间会更长。
5、对照病毒或目的病毒感染细胞以后，细胞形态发生改变或者细胞死亡？
首先，确定病毒是否有污染，常见污染类型及处理方法：
① 细菌污染，病毒用Millipore 0.22um滤器过滤去除细菌；
② 真菌污染，病毒直接丢弃
③ 支原体污染，可用汉恒抗支原体试剂
汉恒慢病毒产品严格质检，确保慢病毒产品没有支原体污染。市场上有些慢病毒供应商为了降低成本缩短周期，削减支原体污染检测工序，不仅影响客户的实验成败，更给客户细胞房污染造成潜在影响。
④ 病毒纯度不够：与供应商联系确认慢病毒产品是否经过超速离心纯化！目前市场上很多低价慢病毒产品仅经过初步纯化，未使用超速离心机进行纯化；
汉恒慢病毒产品全部经过超速离心纯化，尤其适合对杂质敏感的细胞株！
其次，确定病毒感染MOI是否过高，降低MOI值，并在感染后的4h、8h、12h对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。
排除以上因素后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转。
6、如何提高慢病毒对细胞的感染效率？
慢病毒对细胞的感染效率受多种因素影响，如病毒活性、细胞自身的状态、MOI值、感染时间等。
①病毒活性，解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融。-80℃保存半年以上需要重新测滴度；
②目的细胞，先进行预实验测试，看病毒载体是否合适感染目的细胞。一些难感染的细胞，如贴壁不好的细胞，原代细胞等适合用腺病毒；对于悬浮细胞，可采用离心感染的方法，减少病毒感染时的体积，从而提升感染的效率；
③ MOI值，进行MOI梯度摸索实验，找出最优的MOI浓度；
④ 感染时间，慢病毒/逆转录病毒一般在感染后24h换液，太早换液会导致感染效率下降；换液太晚，则对细胞的损伤太大。感染后48h开始观察荧光，由于慢病毒表达时间较长，有的72h、120h才能看到荧光；
⑤ 助转剂，Polybrene有一定的细胞毒性，不同细胞对polybrene的敏感度不同，可以用1-10ug/mL的范围筛选合适的浓度,以24h内细胞无明显毒性反应为佳；
PS：慢病毒带puromycin抗性的可以用嘌呤霉素筛选，也可提高阳性细胞率。
7、细胞能被慢病毒感染，但为何GFP荧光很弱？
GFP慢病毒感染细胞后，荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP前的启动子活性等因素。
GFP基因荧光表达的强度与启动子的活性、目的细胞感染的病毒颗粒数呈正相关。慢病毒在增值较快的细胞中感染72~120ｈ，GFP蛋白表达才达到峰值；在增殖较慢的细胞中感染后，GFP蛋白表达到达峰值需要更久。GFP基因接在强启动子后面时荧光表达较强，弱启动子则荧光表达较弱。
观察荧光时最好关掉室内灯光，只留荧光显微镜光源。
8、为什么过表达慢病毒比对照的荧光要暗？
每种病毒有自己的载体容量，基因的插入会影响位于其下游的荧光蛋白等基因的表达。
对照病毒或干扰病毒，由于没有插入基因或者插入基因非常短，荧光通常较强。而插入了较长基因之后，荧光的亮度会随着插入基因的长度以及特殊结构的存在等而减弱，尤其是出现高GC片段，由于影响了转录，荧光强度会大大降低。
其次，对照病毒相对滴度可能比对照高，同等体积的病毒，对照的病毒量大，可能对细胞的影响大。
第三，有些病毒供应商对照和目的病毒的纯化工艺可能不一致，导致目的或者对照病毒对细胞毒性大。
汉恒生物所有病毒同样的纯化工艺，病毒无支原体污染，质控严格。
9、要曝光很长时间才能观察到荧光？
可能的原因有：
① 显微镜汞灯使用时间长，可以通过对照病毒排除，若对照较亮可排除显微镜问题；
② pH值低，看培养基是否发黄，pH值较低会导致绿色荧光淬灭
③ 目的病毒光不亮，插入目的基因后的病毒荧光强度会相较对照弱一些，属于正常现象，可加长曝光时间。
汉恒生物一直致力于为科研工作者提供优质的产品和服务，所以我们在慢病毒工艺上不断优化，在保证病毒滴度的同时，提升病毒纯度，并且生产过程中严格控制，确保给客户提供优质的无支原体污染的病毒。
在汉恒的努力下，我们的病毒质量也获得了很多客户认可，细心的客户还给我们反馈了产品质量对比图：
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