我国慢性肝病（包括慢性肝炎、脂肪肝和肝硬化等）患者人数超过4亿。终末期肝病（肝硬化和肝衰竭）和原发性肝癌是为我国肝脏移植的主要适应证。阻止或延缓慢性肝病向肝硬化、肝衰竭和肝癌的发展，可以从源头上减少对移植肝的需求。
肝纤维化是各类慢性肝病进展至肝硬化、肝衰竭或肝癌的必经之路。肝纤维化是一种由各种病因引起的伤口愈合反应。据报道，中间丝蛋白家族成员巢蛋白（Nestin）在伤口愈合反应期间参与维持组织内稳态。然而，目前对巢蛋白在肝纤维化中所起的作用知之甚少。
来自中山大学附属第三医院的研究人员在国际顶级期刊Journal of Hepatology（IF>20）发表了题为Targeting Nestin+ hepatic stellate cells ameliorates liver fibrosis by facilitating TβRI degradation的文章，探讨了巢蛋白在肝纤维化过程中的功能及其精确的调控网络。文中使用到的腺相关病毒来自汉恒生物。
研究方法
通过免疫染色和实时定量PCR检测纤维化/肝硬化样品中巢蛋白的表达。
通过萤光素酶报告基因检测研究了转化生长因子β（TGFβ）-Smad2/3信号转导诱导巢蛋白的表达。
通过检测巢蛋白干扰后促纤维化TGFβ-Smad2/3信号通路的活性和TGFβ受体I (TβRI)的降解，研究巢蛋白在肝星状细胞(HSCs)中的功能作用。
用干扰巢蛋白的腺相关病毒载体AAV6(汉恒生物)检测了在纤维化小鼠模型中下调巢蛋白的体内效果。
研究结果
巢蛋白主要在活化的肝星状细胞中表达，并随着肝纤维化的进展而增加。促纤维化途径TGFβ-Smad2/3直接诱导巢蛋白表达。Nestin可通过调控Caveolin1影响TβRI降解速率在促纤维化主要通路TGFβ-Smad2/3信号通路激活中发挥重要作用。在AAV6处理的小鼠纤维化模型中，下调巢蛋白可降低炎症浸润水平、肝细胞损伤和纤维化程度。
TGFβ诱导HSC中巢蛋白的表达，并与肝纤维化程度呈正相关。在体内和体外，巢蛋白的下调降低了TGFβ途径的活化，并减轻了肝纤维化。该研究首次揭示了Nestin在肝纤维化进程中的生理功能与调控网络，为肝纤维化防治提供了重要的理论依据。
研究分析
■为了确定Nestin是否与肝纤维化相关，作者使用了两个成熟的肝纤维化模型，CCl4和DDC模型，通过实验证明Nestin的表达在纤维化肝样本中比正常肝样本多，而Nestin的高表达与更严重的肝纤维化密切相关。详见图1。
图1 Nestin表达水平与肝纤维化进展相关
(A&B)左:在(A) CCl4和(B) ddc诱导纤维化模型的指定组中，PSR染色、α-SMA免疫组化、Nestin免疫组化和Nestin IF(绿色)的代表性照片。右上:PSR染色定量(上)，左下:Nestin IHC染色定量(下)。N = 6 /组。在IF中用DAPI对细胞核进行染色。(C)对CCl4和ddc模型不同时间点的对照和纤维化肝组织进行巢蛋白和纤维化基因的qPCR检测。这些值根据18s值归一化，称为油对照(用于CCl4模型)或正常饮食对照(用于DDC模型)。N = 6 /组。(D)采用qPCR方法分析健康对照和不同病因(HBV、HCV、ALD、BA和PBC)纤维化肝脏中NESTIN mRNA水平的log2倍变化。数据根据GAPDH值归一化，并与健康对照(正常)进行比较。(E)人体健康对照和各种病因肝纤维化的NESTIN和PSR免疫组化的代表性照片。(F)在HBV或hcv诱导的人纤维化/肝硬化中，Ishak评分与NESTIN IHC评分的Pearson相关性分析。
■补充试验中检测到Nestin主要定位于纤维化间隔，表明Nestin可能在纤维化激活的肌成纤维细胞中上调。为了研究纤维化中表达巢蛋白的主要细胞类型，作者通过共染色等实验，验证了Nestin主要在HSCs细胞中增加。详见图2。
图2 肝损伤后hsc中Nestin表达增加
(A) Nestin(绿色)与小鼠肝组织中α-SMA(红色)、Alb(红色)、CK19(红色)、F4/80(红色)、CD31(红色)共染色的代表性荧光照片。细胞核经DAPI染色。(B) NESTIN(绿色)与α-SMA(红色)在正常和HBV或ba诱导的人肝纤维化共染色的代表性荧光照片。(C) FACS的代表性直方图。(D) Nestin- gfp的平均荧光强度(MFI)定量。(E) Nestin在Vit中的qPCR。从CCl4或ddc处理的nstin - gfp小鼠中获得对照和纤维化肝的A+、CD31+和F4/80+细胞。N = 5 /组。(F&G) GFP(绿色)和IF (α-SMA)或Desmin(红色)GFP+ Vit的代表性荧光照片。(F) CCl4或(G) ddc处理的nstin - gfp小鼠的A+细胞经流式分选。
■HSCs激活后，Nestin表达增强，作者进一步探索Nestin在肝纤维化微环境中的诱导机制。研究表明，在肝纤维化过程中，TGFβ- smad2 /3通路被持续激活，TGFβ可通过HSCs NESTIN启动子上的功能性SBEs诱导NESTIN。详见图3。
图3 HSCs中Nestin表达对TGFβ刺激的影响
(A) qPCR和(B) L02、LX2和经TGFβ或未经TGFβ处理48 h的小鼠原代造血干细胞中NESTIN的代表性western blot检测。GAPDH为对照。(C)LX2和小鼠原代造血干细胞NESTIN和α-SMA的代表性western blot检测。用SB431542、TGFβ 或SB431542 + TGFβ处理细胞48小时。(D)在指定组的LX2 3D球状体中，IF染色α-SMA(红色)和NESTIN(绿色)的代表性荧光照片。(E) HEK293T细胞共转染Renilla和NESTIN启动子的不同pgl3构建物的荧光素酶报告实验。转染24小时后，细胞经TGFβ 处理或不处理48小时。测量荧光素酶活性。(F)NESTIN启动子结构和突变体结构示意图(左)和HEK293T细胞共转染Renilla和指示结构的荧光素酶报告实验(右)。红色方块代表SBEs。转染24小时后，细胞用TGFβ 处理48小时。
■为了研究Nestin对肝纤维化的功能影响，作者在HSCs和LX2细胞中使用shRNA敲低Nestin，证实了HSCs中Nestin的下调阻碍了TGFβ-Smad2/3通路，从而拮抗促纤维化基因的表达。详见图4。
图4 下调Nestin的表达会抑制TGFβ-Smad2/3的活性
(A) 和(B)Nestin和纤维化基因的对照和Nestin下调小鼠原代造血干细胞(左)和LX2(右)与TGFβ处理或不处理48 h的QPCR和WB。(C)用TGFβ (5 ng·mL 1)处理的LX2细胞中NESTIN，磷酸化的和总Smad2/3的代表性wb检测。(D)各组小鼠原代造血干细胞中Nestin(绿色)和磷酸化Smad2/3(红色)的代表性荧光照片。(E)转染了pgl3 -SBE9-荧光素酶(SBE9, 9个SBEs串联重复序列)的小鼠原代造血干细胞(左)和LX2(右)的对照和巢蛋白敲除的荧光素酶报告实验。(F)对照中α-SMA(红色)和NESTIN(绿色)的代表性荧光照片，以及NESTIN表达下调的LX2 3D球状体经tgf β处理或未处理48 h后的代表性荧光照片。
■由于蛋白结合亲和预测表明Nestin可能与TβRs相互作用，作者检测了Nestin是否能在肝纤维化过程中调节TβRs。结果表明，Nestin的下调显著降低了TβRI的蛋白水平，Nestin可保护TβRI免受泛素化和蛋白酶体降解的影响。详见图5。
图5 Nestin的下调通过泛素-蛋白酶体途径促进TβRI的降解
(A)对照和Nestin下调小鼠原代造血干细胞(左)和LX2(右)的代表性wb和(B) TβRs的qPCR。(C)用CHX处理LX2细胞，对对照组和NESTIN和TβRI进行wbl检测。(D)(C)中TβRI相对GADPH水平的密度测定分析。(E)代表免疫印迹(上)和微量化(底部)巢蛋白和TβRI在控制和NESTIN-knockdown LX2细胞治疗或没有MG132(20米)6 h。(F)代表泛素化分析TβRI泛素化LX2细胞中NESTIN敲除。(G)NESTIN和TβRI的wb检测对照和NESTIN下调的LX2细胞在m - β cd 处理或不处理4 h。
■既往研究表明，脂筏的重要组成部分Cav-1可与TβRs相互作用，介导其内吞和降解。也有报道称，中间丝可以与Cav-1相互作用，参与调控囊泡运输。因此，作者推测Nestin通过调节Cav-1和TβRI之间的相互作用来调节TβRI的降解。通过实验也表明，敲除NESTIN可以促进CAV-1介导的hsc中的TβRI降解。这些数据表明在肝纤维化过程中TGFβ-Smad2/3通路和Nestin之间存在一个正反馈回路。详见图6。
图6 巢蛋白保护TβRI免受Cav-1介导的降解
(A) TβRI的Co-IP与CAV-1和NESTIN的wb (上)，CAV-1与TβRI和NESTIN(中间)， Flag-NESTIN 和 TβRI 、CAV-1 (下)。(B) LX2细胞中NESTIN(绿色)与CAV-1(红色)(左)和NESTIN(绿色)与TβRI(红色)(右)共染色的荧光照片。(C)对照和nestin敲除LX2细胞中指示基因的wb(上)和qPCR(下)。(D&E)在MG132 (20 M)处理6 h后，对照组和nstin下调的LX2细胞中TβRI和CAV-1的代表性Co-IP。(F)对照和nstin下调的LX2细胞中TβRI(绿色)和CAV-1(红色)受体内吞测定的代表性荧光照片(左)和定量分析(右)。(G) LX2细胞中NESTIN、CAV-1和TβRI的wb(左)和密度定量(右)。(H) 荧光照片(上)和IF的MFI定量(下)在指定组的LX2细胞中磷酸化Smad2/3(红色)。
(I) qPCR检测各组LX2细胞纤维化基因。在收获前用TGFβ处理48小时或不处理细胞。
■最近的研究表明，在肝纤维化期间，AAV6对活化的肝星状细胞显示出亲和性。作者在肝纤维化小鼠中使用AAV6-shNestin，研究Nestin在ccl4诱导的体内肝纤维化中的作用。AAV6-shNestin治疗组肝细胞损伤和纤维化程度减轻。DDC模型中，AAV6-shNestin治疗后观察到肝纤维化恢复。表明，AAV6靶向Nestin减轻了体内肝纤维化。详见图7、图8。
图7 抑制Nestin可减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化
(A)实验设计概述(B)各组肝组织IF染色Nestin(红色)和α-SMA(白色)的荧光照片。(C)苏木精和伊红(HE)， PSR染色和免疫组化α-SMA，免疫组化Nestin。(D) PSR染色(E)巢蛋白包含IHC;(F)羟脯氨酸(Hyp)含量。N = 6 /组。(G)各组小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和总胆红素(TBIL)水平。N = 6 /组。(H) qPCR检测各组小鼠肝脏组织的巢蛋白、促纤维化基因和炎症基因。N = 6 /组。
图8 下调Nestin可减轻ddc诱导的小鼠肝纤维化
(A)实验设计概述(B)各组肝组织IF染色Nestin(红色)和α-SMA(白色)的代表性荧光照片。(C)代表性的HE, PSR染色和免疫组化用于α-SMA，免疫组化用于Nestin。(D) PSR染色;(E)巢蛋白包含IHC;(F)指定组肝组织中Hyp含量。N = 6 /组。(G)各组小鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL水平。N = 6 /组。(H) Nestin、促纤维化基因的qPCR检测N = 6 /组。
本研究探讨巢蛋白在肝纤维化过程中的作用及其精确调控。巢蛋白的下调降低了TGFβ途径的活化，并减轻了肝纤维化。该研究首次揭示了Nestin在肝纤维化进程中的生理功能与调控网络，为肝纤维化防治提供了重要的理论依据。由于AAV载体免疫原性低，在临床试验中被认为是一种安全有效的基因传递工具。因此，文章使用携带shNestin的AAV6载体（汉恒生物）靶向激活的造血干细胞，观察到肝纤维化明显恢复。体内外实验结果表明，靶向Nestin能使造血干细胞恢复到静止状态，并抑制细胞增殖。但对细胞凋亡的影响微乎其微。这是由静止的星状细胞标志胶质纤维酸性蛋白(GFAP)增加而激活标志a-SMA表达减少以及靶细胞中Ki67阳性细胞减少而TUNEL阳性细胞不变所证明的。然而，在AAV6给药后，只有一小部分Nestin+ hsc被靶向。
近年来，除AAV载体外，脂质体等基于纳米材料的靶向小干扰rna (sirna)和小分子靶向肝星状细胞的工具也得到了发展。这些药物在肝纤维化治疗中显示出了更好的靶向性和巨大的前景。因此，进一步探索以巢蛋白为靶点的其他治疗方法是很有意义的，这可能为抗纤维化策略的发展提供新的见解。
- 浏览 1972 次
